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本制品是表达纯化获得的重组蛋白酶。WELQut蛋白酶能特异性地识别四肽序列Trp-Glu-Leu-Gln (W-E-L-Q)，并对Gln (Q)之后的肽键进行酶切，常用于重组蛋白除去His或者其它融合标签，其最突出优势是酶切后不会在目的蛋白的N端留下任何额外的氨基酸残基。

本WELQut蛋白酶反应条件比较宽泛。WELQut蛋白酶是一种源自金黄色葡萄球菌的丝氨酸蛋白酶类似蛋白，该蛋白酶反应时不需要特殊的反应缓冲液，能在比较宽泛的温度区间(4～30℃)及pH区间(6.5-9.0)识别WELQ多肽序列，并在Gln (Q)之后进行蛋白或多肽的剪切。

本WELQut蛋白酶能适用于His标签蛋白的柱上酶切。本WELQut蛋白酶带有His标签，特别适用于His标签蛋白的柱上酶切。在切割His标签蛋白的时候，切下的His标签和WELQut蛋白酶可结合于His纯化柱上，而目的蛋白在穿透液中，这样洗脱下来的蛋白中理论上就不会含有His标签和WELQut蛋白酶，极大地方便了目的蛋白的纯化。如果不进行柱上酶切，分别过镍柱和能除去目的蛋白融合标签的纯化柱也可以方便地去除WELQut蛋白酶和目的蛋白上切割下来的标签。

组分	500U	2500U	10kU
WELQut蛋白酶(5U/μL)	100μL	500μL	2mL
说明书	1份

保存：-20℃，有效期2年。


10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，50% (v/v) Glycerol，pH7.3。


WELQut Protease的酶切体系中可以兼容：0.01～1% Triton X-100/Tween-80，5～50mM DTT，100mM NaCl，20～300mM Imidazole，100mM Tris-HCl (pH8.0)，100mM Na3PO4 (pH7.4)，20mM K3PO4 (pH7.4)。


WELQut Protease分子量大小约22kDa，纯度≥95%。不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。


2M尿素、0.25M盐酸胍会抑制WELQut Protease的部分酶活性。



图1.我司的WELQut蛋白酶与T公司同类产品切割GST标签融合蛋白(WELQ四氨基酸序列位于GST和10kD目的蛋白之间)的效果图。将含有WELQut Protease识别位点的36kD GST标签融合蛋白与WELQut Protease进行反应，底物的用量为50μg，酶的用量分别为1U和2U，在50mM Tris-HCl (pH8.0)的缓冲液中反应，设置4℃与25℃两种反应温度，在反应0、1、3、6小时以及过夜(Overnight,O/N) (超过16小时)后取样，进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。酶切产物大小为约10kD的目的蛋白和约26kD的GST标签。如图所示，本制品与T公司的竞品具有相当的活性。实际效果会因样品种类、检测条件等不同而存在差异，本图仅供参考。

• WELQut Protease酶切条件优化：
  WELQut Protease识别位点的暴露程度、位点附近的氨基酸序列以及蛋白的聚集程度都会影响WELQut Protease的酶切效果。因而对不同的蛋白进行酶切时，建议通过预实验来优化酶切条件。建议从以下三个方面进行酶切条件的优化：反应温度(4～30℃)、反应时间(1-12h或过夜)、酶的用量(酶活性单位数量与目的蛋白μg数比例(U/μg)为1:5～1:100)。如下是一个简单的摸索酶用量、反应时间的实验方案。a.按照下表设置酶切反应体系：
  

  成分	用量
  Target Protein	50μg
  WELQut蛋白酶(5U/μl)	0.5/1/2/10U
  Reaction Buffer	To 50μL

  • 设置酶与底物蛋白的比例分别为1:10、1:50、1:25、1:5(U/μg)。除1:5的比例外，建议将WELQut Protease稀释至0.5U/μl后使用。
    
  • 建议使用10～100mM Tris-HCl (pH8.0)作为Reaction Buffer。
• 将反应混合物置于15～30℃反应。分别在反应1、3、6、12小时(或过夜)后，取出10μL酶切产物，用于后续的SDS-PAGE检测。当反应时长大于16小时时，建议酶切反应温度设置在20℃以下。
  
• 将上一步骤的留取的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析，选择比较理想的反应的条件。确定了优化后的反应条件后，后续可以等比例扩大反应体系，选择进行溶液体系中的酶切或柱上酶切。如果用于柱上酶切，可能后续还需要进一步的调整酶用量等的酶切条件优化。
  
• 融合蛋白在溶液体系中的酶切和纯化：
  
  • 推荐使用10～100mM Tris-HCl (pH8.0)、10～100mM Na3PO4 (pH7.4)或10～20mM K3PO4 (pH7.4)作为Reaction Buffer进行酶切。
    
    • 如果酶切后的目的蛋白后续需要进行亲和层析，Reaction Buffer可以含有50mM NaCl以及5～20mM Imidazole。
  • 按照优化后的酶与目的蛋白的比例和酶切时间，加入WELQut Protease，在15～30℃中进行反应。
    
    • 如果蛋白不稳定或者酶切反应时长大于16小时，建议选用4～20℃进行反应。
  • 将酶切后的蛋白样品加入预先用Reaction Buffer平衡好的GoldBalb His-tag Purification Resin (货号：YT616、YTB4204)中，室温结合20～30分钟。
    
  • 500×g离心5分钟，收集上清，其中含有切除了标签的目的蛋白，WELQut Protease则结合在凝胶沉淀中。如果目的蛋白是His标签蛋白，那么残留的没有被酶切的His标签蛋白、WELQut Protease和酶切下来的His标签则结合在凝胶沉淀中，切除了标签的目的蛋白在溶液中。如果目的蛋白不是His标签融合蛋白，那么切除下来的带有WELQ的片段，还需要用适当的方法去除，例如如果是GST标签，那么可使用GST纯化柱去除GST标签。
• 融合蛋白的柱上酶切和纯化：
  如果目的蛋白带有His标签并且His标签的羧基端(C端)同时带有WELQ序列，本WELQut Protease可以在镍柱亲和层析过程中进行融合蛋白的酶切。目的蛋白在与镍柱结合时被切割，并进一步被洗脱，留下目的蛋白的His标签和带有His标签的WELQut Protease于柱上。
  
  • 利用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色估计待纯化和酶切的目的蛋白的总量。
    
  • 按照常规操作流程将目的蛋白结合至镍柱上。
    
  • 使用2～4倍柱体积缓冲液，如50～100mM Tris-HCl，50mM NaCl，5～20mM Imidazole (pH8.0)、50～100mM Na3PO4，50mM NaCl，5～20mM Imidazole (pH7.4)，或者10～20mM K3PO4，50mM NaCl，5～20mM Imidazole (pH7.4)，平衡亲和层析柱2次。
    
  • 按照酶切优化实验中确定的蛋白酶/重组蛋白比例，将WELQut Protease加入上一步镍柱平衡用的缓冲液中混匀后，加到柱上。
    
    • 如果蛋白酶/重组蛋白比例尚未确定，推荐使用1:20(U/μg)或者1:10(U/μg)的比例。
  • 在15～30℃中反应适当时间。
    • 如果反应时长尚未确定，推荐在4～20℃中反应12小时或者过夜。
  • 收集洗脱下来的目的蛋白。亲和标签和带有His标签的WELQut Protease结合于柱上。

• 为什么酶切不完全？
  
  • 可能是酶与底物蛋白的比例不合适。建议确定待酶切目的蛋白的含量，调整加入WELQut蛋白酶的量。
    
  • 可能是孵育时间不够长。建议延长反应时间。
    
  • 可能是酶切位点并未表达或发生了突变。建议测序确认序列是否正确。
    
  • 可能是酶切位点并未暴露出来。建议尝试使用非离子型变性剂(如0.01～1% Triton X-100/Tween-80)使蛋白发生可逆变性，从而将酶切位点暴露出来。
    
  • 可能是缓冲液内含有WELQut蛋白酶的抑制剂。建议将目的蛋白透析至合适的反应缓冲液中。
• 为什么会出现不正确的条带？
  
  • 可能是目的蛋白上出现了其它类似的酶切位点。建议调整酶切条件(如盐浓度、反应时间或者温度)，降低类似酶切位点的暴露程度。如果待表达纯化的目的蛋白本身含有WELQ序列，就不适合使用WELQut蛋白酶进行酶切了。
    
  • 可能是蛋白在菌体内发生降解。建议使用蛋白酶缺陷的菌株。

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